文章摘要
周 勇,曾令兵,孟 彦,周群兰,张 辉,高正勇,肖 艺,孙建滨.大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].水产学报,2012,36(5):772~778
大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
Establishment of a TaqMan real-time PCR assay for detecting the giant salamander iridovirus
投稿时间:2012-01-04  修订日期:2012-02-15
DOI:10.3724/SP.J.1231
中文关键词: 大鲵  虹彩病毒  主要衣壳蛋白  TaqMan 实时荧光定量PCR
英文关键词: Andrias davidianus  giant salamander iridovirus  MCP protein  TaqMan real-time PCR
基金项目:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心基本科研业务费(2011JBFZ01); 中国水产科学研究院基本科研业务费资助(2012A0505); 公益性行业(农业)科研专项经费(201203086)
作者单位
周 勇 中国水产科学研究院长江水产研究所 
曾令兵 中国水产科学研究院长江水产研究所 
孟 彦 中国水产科学研究院长江水产研究所 
周群兰 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 
张 辉 中国水产科学研究院长江水产研究所 
高正勇 华中农业大学水产学院 
肖 艺 中国水产科学研究院长江水产研究所 
孙建滨 华中农业大学水产学院 
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中文摘要:
      利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。
英文摘要:
      A 1 392 bp coding region of giant salamander iridovirus(GSIV)MCP protein was amplified by PCR and cloned into pMD19-T vector for the construction of recombinant plasmid pMD19-T-MCP. After being identified and confirmed by PCR reaction, 10-fold serial dilutions of plasmid pMD19-T-MCP were used as standard templates for TaqMan real-time PCR to generate standard curve for quantifying the virus genomic copy number. A good linear correlation was demonstrated in the standard curve for the real-time PCR assay. The coefficients of variance (CV) were 0.52% for intra-assay tests, which indicated good reliability. The detection results showed that the specificity of this assay was high for giant salamander iridovirus without cross-reactions with DNA templates from KHV, Aeromonas hydrophila, Citrobacter freundii and EPC cells. A minimum of 10 copies of GSIV DNA (1.1×10-3 pg/μL total DNA) could be detected, which indicated that the sensitivity of real time PCR is about 1000 times higher than that of the conventional PCR assay. The TaqMan real-time PCR assay established in this study is considered to be a powerful tool for the rapid detection and quantification of GSIV in giant salamander.
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