文章摘要
张醴溪,杨圆圆,方伟,付小哲,林强,李趁,刘礼辉,梁红茹,黄志斌,吴志新,李宁求.基于病毒mRNA监测的传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验方法建立及其应用[J].水产学报,2017,41(9):1464~1472
基于病毒mRNA监测的传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验方法建立及其应用
Establishment and application of a rapid assay for inactivated infectious spleen and kidney necrosis virus based on viral mRNA
投稿时间:2016-08-25  修订日期:2017-01-11
DOI:10.11964/jfc.20160810514
中文关键词: 传染性脾肾坏死病毒  灭活疫苗  灭活检验  mRNA  荧光定量RT-PCR
英文关键词: infectious spleen and kidney necrosis virus  inactivated vaccine  inactivation test  mRNA  Real-time RT-PCR
基金项目:国家科技支撑计划(2012BAD25B02);广东省海洋渔业科技推广专项(A201501B12)
作者单位E-mail
张醴溪 华中农业大学水产学院, 湖北 武汉 430070  
杨圆圆 广东省水生动物疫病预防控制中心, 广东 广州 510222  
方伟 广东省水生动物疫病预防控制中心, 广东 广州 510222  
付小哲 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
 
林强 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
 
李趁 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
 
刘礼辉 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
 
梁红茹 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
 
黄志斌 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380  
吴志新 华中农业大学水产学院, 湖北 武汉 430070
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
 
李宁求 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业部渔用药物创制重点实验室, 广东省水产动物免疫技术重点实验室, 广东 广州 510380
淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 湖北 武汉 430070 
liningq@126.com 
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中文摘要:
      为建立传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检验方法,从ISKNV感染CPB细胞系转录谱筛选并经qRT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以质粒pMDORF099为标准品,采用qPCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其线性方程为CT=–3.42lgx+39.455,最低检测限为3拷贝/μL,结果显示组间和组内变异系数均小于2%,表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。将ISKNV病毒悬液10倍稀释成100~103拷贝/mL,分别取1 mL病毒稀释液接种CPB细胞,在第7、9和11天提取细胞总RNA,经基因组DNA去除试剂盒去除残留DNA后采用qRT-PCR方法检测ORF099基因转录本,结果显示在第7天即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。将3个浓度梯度(0.05%、0.1%、0.2%)的甲醛灭活ISKNV制备的模拟样品以及实验室制备的3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品接种CPB细胞9 d,采用上述快速检验方法进行检测。0.05%、0.1%甲醛灭活模拟样品可检测到ISKNV ORF099基因转录本,其他样品均未检测到。而细胞盲传实验显示,0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV接种细胞盲传3代未出现CPE,鱼体安全实验显示接种鱼体后无临床发病症状和实验鱼死亡,表明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全实验具有更高的灵敏度,与传统检测方法相比具有灵敏度高、耗时短、检测效率高等优点,对提高ISKNV灭活疫苗生产效率具有重要意义。
英文摘要:
      In order to establish a rapid assay for inactivated infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV), ISKNV ORF099 was selected as a promising target gene based on the results of transcriptomic profiles of Mandarin fish brain cells (CPB) infected with ISKNV and qRT-PCR. Standard curve of CT value and plasmid copy number was drawn with standard plasmid pMD099, and the linear equation was:CT=-3.42lgx+39.455, and the minimum detection limit was 3 copies/μL. Results of repeated trials showed variation coefficients of intra-and-inter groups were less than 2%, indicating the method has high sensitivity and repeatability. The ISKNV suspension was diluted into 100–103 copies/mL, and each T25 cell culture flask was inoculated with 1 mL virus diluted solution. Thereafter, total RNAs were extracted at 7, 9 and 11 d post inoculation. The mRNA of ORF099 gene was detected using routine qRT-PCR method. The results showed that the mRNAs of ISKNV could be detected from cells inoculated with one copy ISKNV virus at 7 days post inoculation. CPB cells have been inoculated with three batches of ISKNV inactivated by different concentrations (0.05%, 0.1%, 0.2%) of formaldehyde for 9 days. Results showed that ISKNV ORF099 mRNA was only detected from cells inoculated with 0.05% and 0.1% formaldehyde inactivated ISKNV at 7 days post inoculation by qRT-PCR. However, after blind passaging three generations, cells inoculated with ISKNV inactivated by 0.1% final concentration of formaldehyde did not exhibit CPE. The inactivated ISKNV did not cause clinical symptoms and death of fish, indicating this rapid virus inactivation test has higher sensitivity than cell blind passage trial and the fish safety test. The established method will be important for improving the ISKNV inactivated vaccine production.
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